Amélioration spectaculaire de l'analyse du protéome Zebrafish du foie tumeur par extraction efficace des protéines
Département des sciences biologiques, Université nationale de Singapour, 14 Science Drive 4, Singapour 117543
Editeur universitaire: Mohamed Abdel-Rehim
La majorité des études protéomiques sur des échantillons de tissus impliquent l'utilisation de l'approche à base de gel pour le profilage et la digestion. L'approche basée sur un gel laborieux est lentement remplacé par l'approche de la digestion avançant en solution. Cependant, il y a encore plusieurs difficultés telles que les protéines difficiles à solubiliser, une mauvaise analyse protéomique dans des échantillons de tissus complexes, et la présence d'impuretés échantillons. Désormais, il y a une grande demande de formuler un tampon d'extraction de protéines très efficace avec une efficacité d'extraction haute teneur en protéines à partir d'échantillons de tissus, une grande compatibilité avec la digestion en solution, réduction du nombre d'étapes de manipulation des échantillons pour réduire les pertes d'échantillons, une faible consommation de temps, à faible coût, et la facilité d'utilisation. Ici, nous avons évalué différents tampons d'extraction de protéines existantes avec des échantillons de tumeurs du foie de poisson zèbre et constaté que deoxycholate- de sodium (DOC-) basé tampon d'extraction avec dénaturation thermique est l'approche la plus efficace pour l'extraction très efficace des protéines à partir de tissus complexes tels que la tumeur du foie zebrafish . Un total de 4.790 protéines ont été identifiées à l'aide approche protéomique fusil 2D LC, qui à notre connaissance est l'étude la plus complète pour protéome de tumeur du foie du poisson zèbre.
1. Introduction
Il est de plus en plus important de profil des protéines afin de comprendre les processus biologiques dans une ère post-génomique comme la dynamique des protéines entre les cellules à différentes époques et dans différentes conditions environnementales fournissent un phénotype biologique réel. En particulier, la présence de protéines dans les modifications post-traductionnelles met également en évidence l'importance de l'analyse protéomique qui ne peut être remplacée par d'autres approches génomiques [1]. Pour le profil du protéome d'échantillons de tissus, les protéines doivent être extraites en utilisant un solvant concerné. À l'heure actuelle, il existe deux approches principales pour préparer les échantillons de tissus pour l'analyse du protéome. La première approche, dite aussi séparation à base de gel et dans le gel digestion, implique l'utilisation de détergents tels que SDS à solubiliser les protéines avant la séparation par SDS-PAGE et digestion subséquente des protéines piégées dans le gel [2]. La seconde approche, appelée aussi en solution digestion, implique l'utilisation de réactifs chaotropes tels que l'urée et de solides thiourée pour solubiliser les protéines avant la digestion des protéines dans la solution [3].
Dans cette étude, nous avons évalué divers tampons d'extraction de protéines existantes (tampon SDS, RIPA, l'urée, 2D, le désoxycholate de sodium (DOC), et du bicarbonate de triéthylammonium (TEAB) / urée / triton-X / SDS (TUTS) [14]) pour leur l'extraction des protéines et de l'efficacité de la digestion dans solubilisation solution en utilisant les deux 1D protéomiques SDS-PAGE et fusil de chasse approches. Comparaison de l'efficacité à l'aide de ces approches a indiqué que le DOC était le tampon d'extraction de protéines la plus efficace dans notre étude. Nos résultats fournissent les preuves pour l'application effective de tampon d'extraction de protéines à base de DOC dans les études protéomiques basées sur MS sur l'ensemble tumeur du foie de poisson zèbre et notre méthode pourrait être appliquée à d'autres échantillons de tissus à travers différents organismes pour l'analyse protéomique.
2. Matériels et méthodes
2.1. Produits chimiques et réactifs
Tous les réactifs étaient de qualité ACS ou plus; tous les solvants utilisés, y compris l'eau, sont de qualité LC / MS. Urée, SDS, DOC, bicarbonate de triéthylammonium (TEAB), le tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP), l'acide phosphorique, et l'acide formique ont été achetés chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). trypsine de qualité Le séquençage a été obtenu à partir de Promega (Madison, WI). méthanethiosulfonate de méthyle (STFM) a été acheté chez Pierce, Thermo-Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL). Sauf indication contraire, tous les autres réactifs utilisés pour les méthodes biochimiques ont été achetés chez Sigma-Aldrich. LC / MS de qualité ACN et de l'eau de qualité LC / MS ont été achetés chez Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA).
2.2. Zebrafish Préparation de l'échantillon
Tableau 1: Vue d'ensemble des différents tampon de lyse et le nombre de protéines identifiées en utilisant 1D LC-MS / MS analyse de fusil de chasse.
2.3. 1D SDS-PAGE Comparaison des Zebrafish du foie tumeur Proteome Extrait Utilisation de plusieurs buffers
2.4. Foie tumeur protéome-Solution Digestion
2.5. Nettoyage échantillon avant LC-MS / MS
2.6. Identification des protéines et Quantification
2.7. Gene Ontology et analyse Pathway
Les protéines identifiées ont été soumis à l'ontologie gène (GO) analyse en utilisant l'outil logiciel pour rapide Annotation des protéines (STRAP) v1.5.0.0 [19]. L'analyse de la voie a été réalisée en utilisant le logiciel v21249400 Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Qiagen, Hilden, Allemagne). Les chiffres générés ont été extraites des IPA.
3. Résultats et discussion
3.1. 1D SDS-PAGE Montré une meilleure efficacité d'extraction des protéines avec SDS et DOC
Après l'extraction de la protéine à partir du tissu de tumeur du foie récoltées en utilisant les divers tampons d'extraction, 1D analyse SDS-PAGE a été réalisée pour fournir une indication visuelle initiale de l'efficacité de l'extraction des protéines. Comme représenté sur la figure 1. l'extraction des protéines à l'aide du tampon d'extraction de DOC est potentiellement mieux que les autres tampons d'extraction, comme en témoigne le plus grand nombre de bandes de protéines ainsi que des bandes d'intensité plus élevée dans les échantillons de lysat de protéine extraite DOC. Nos résultats étaient comparables à ceux d'une étude précédente menée par Proc et al. [23], qui ont démontré que les deux SDS et DOC sont des dénaturants plus supérieure que l'urée en termes de la plus grande quantité de protéines plasmatiques humaines solubilisés. Ceci pourrait expliquer le plus grand nombre de bandes de protéine dans les échantillons de tumeurs du foie extraites avec du SDS ou DOC. Cependant, dans des tampons d'extraction comme RIPA et TUTS, la concentration de SDS et DOC pourrait être trop faible pour obtenir des résultats comparables à ceux des tampons d'extraction SDS ou DOC.
Figure 1: CBB gel coloré à partir du 1D SDS-PAGE de protéines extraites à partir des échantillons de tumeurs du foie à l'aide de divers tampons d'extraction. La concentration de charge de chaque échantillon reflète la quantité de protéines extraites à partir des échantillons de foie avant la digestion par la trypsine. Plus grand nombre de bandes de protéines signifierait plus grand nombre de protéines extraites. Sombres bandes protéiques provenant de chaque voie se traduirait par une plus grande quantité de protéines extraites. Les boîtes noires indiquent les deux meilleurs tampons d'extraction et les conditions en termes de nombre de bandes de protéines et l'intensité de la tache CBB. Les régions mises en évidence pour les pistes 2 et 7 montrent un plus grand nombre de bandes visibles par rapport à d'autres voies. # X394 chaleur ;:.
En outre, comme représenté sur la figure 1. l'addition de l'étape de dénaturation thermique dans notre protocole a considérablement augmenté le rendement d'extraction en SDS-extrait ainsi que des échantillons extraits DOC. En revanche, l'introduction de l'étape de dénaturation thermique par Proc et al. [23] ne montrent pas une augmentation significative de l'efficacité de la digestion des protéines plasmatiques humaines. Nos observations ont été basées sur la quantité de protéines extraites directement à partir d'un tissu plutôt que l'efficacité de la digestion de la trypsine étudiée par les auteurs. De plus, nos résultats étaient basés sur tout le tissu de la tumeur du foie plutôt que des protéines plasmatiques. Par conséquent, l'ajout de l'étape de dénaturation thermique pourrait améliorer considérablement la quantité de protéines extraites dans notre étude. Par conséquent, nos résultats indiquent la nécessité d'inclure l'étape de dénaturation thermique pour améliorer l'efficacité de l'extraction des protéines du tissu entier.
3.2. 1D LC-MS / MS Shotgun Analyse des SDS- et DOC-Extrait du foie Des échantillons de tumeur
Figure 2: Une comparaison entre les protéines identifiées à partir d'échantillons de SDS-chaleur et la chaleur extraite DOC. Un total de 1.024 protéines uniques ont été identifiées à partir de l'analyse de fusil de chasse 1D.
Bien qu'aucune comparaison directe du profil de fusil de chasse 1D entre SDS # x394; X et DOC # x394; échantillons de tissu tumoral du foie X a été rapporté dans la littérature, une étude réalisée par Zhou et al. [24] de l'évaluation de l'application du SDS dans l'analyse protéomique de membrane de plasma de rat hippocampique a montré que l'utilisation du DOC a donné lieu à une plus grande, bien que sans importance, le nombre de protéines de la membrane plasmatique totale identifiés ou des protéines associées à la membrane que la procédé SDS. Nos résultats ont également montré une différence dans le nombre total de protéines identifiées entre SDS # x394; X et DOC # x394; échantillons X, ce dernier ayant un nombre beaucoup plus important de protéines identifiées.
Pour déterminer si les différentes protéines identifiées à partir des deux groupes diffèrent en fonction de leur localisation subcellulaire, nous avons effectué une analyse GO des protéines en utilisant la base de données D. rerio GIGSL. Dans l'analyse de SDS GO # x394; X et DOC # x394, les échantillons X, la majorité des protéines se trouvent dans le cytoplasme (20 # x25 et x25 25 #; resp .; Figure 3). Les profils de localisation subcellulaire des deux échantillons sont observés très similaires, mais les protéines supplémentaires identifiées à partir du DOC # x394; échantillons X ont donné lieu à une distribution plus uniforme de protéines dans les différents endroits subcellulaire, même détecter des protéines dans le endosomes, qui est absent du SDS # x394; échantillon X. Nos résultats ont mis en évidence la comparabilité de la méthode d'extraction à base de SDS DOC- et dans leur couverture protéome.
Figure 3: localisation subcellulaire des protéines identifiées sur la base de l'analyse GO. (A) 881 protéines identifiées dans DOC # x394; échantillons X; (B) 659 protéines identifiées dans SDS # x394; X générés en utilisant des échantillons STRAP. Les profils de localisation subcellulaire identifiés sont largement similaires entre les deux échantillons, avec seulement le DOC # x394; échantillons X ayant des protéines situées dans l'endosome. Le plus grand nombre de protéines identifiées à partir du DOC # x394; échantillons X a également montré une distribution plus uniforme des protéines dans tous les emplacements subcellulaires. Les pourcentages sont arrondis au nombre entier le plus proche.
3.3. 2D LC-MS / MS L'analyse du foie Shotgun DOC-tumorale Extrait échantillon
Etant donné que le tampon d'extraction DOC a pu extraire plus de protéines du noyau et divers organites par rapport au tampon d'extraction SDS, cela pourrait augmenter la couverture protéome du foie entier en utilisant le poisson zèbre tampon d'extraction DOC. Pour augmenter encore la couverture de l'ensemble protéome pour les tumeurs du foie, nous avons effectué une analyse shotgun LC-MS 2D / MS (fusil de chasse 2D) sur le DOC # x394; échantillon X depuis notre analyse de fusil de chasse 1D a révélé une meilleure couverture protéome par extraction DOC tampon.
Figure 4: Répartition des protéines identifiées à partir de l'ensemble de données de fusil de chasse 2D d'échantillons de tumeurs hépatiques extrait DOC-basé sur (a) la localisation subcellulaire; (B) des procédés biologiques; (C) des fonctions moléculaires. Un total de 4.790 protéines ont été utilisés dans cette analyse de GO à l'aide STRAP. Les pourcentages sont arrondis au nombre entier le plus proche.
Le regroupement du jeu de données 2D fusil de chasse a indiqué que les protéines identifiées étaient bien représentées dans divers endroits subcellulaire, rejetant ainsi la possibilité de localisation subcellulaire biasness. Comme cela est illustré sur la figure 4 (a). les protéines identifiées ont été provenaient de divers endroits subcellulaire, surtout du noyau (17 # x25;), les mitochondries (8 # x25;), et les différents organites. En particulier, la présence de protéines de membrane de plasma (4 # x25;) dans notre ensemble de données de fusil de chasse 2D prend en charge l'étude précédente sur l'efficacité du DOC à l'extraction de mauvaises protéines solubles dans l'eau tels que des protéines de membrane de plasma par Zhou et al. [24]. Ceci permet d'obtenir un soutien supplémentaire à l'utilisation de DOC pour l'extraction de tissu de foie et d'autres organes.
D'après notre analyse GO pour les processus biologiques, nous avons identifié des protéines impliquées principalement dans le processus cellulaire (40 # x25;), le règlement (19 # x25;), processus de développement (9 # x25;) et la localisation (8 # x25 ;; Figure 4 (b)). Notre analyse de GO pour les fonctions moléculaires identifiées principalement des protéines ayant une activité catalytique (44 # x25;) et les fonctions de liaison (42 # x25 ;; Figure 4 (c)). D'après notre analyse de GO, nous avons démontré la capacité de notre méthode d'extraction de protéines à base de DOC pour générer des données protéomiques, fournissant une plate-forme pour permettre l'extraction des protéines à partir de divers organes pour l'étude des maladies par des approches protéomiques.
3.4. Identification des protéines impliquées dans les voies de signalisation importantes du cancer du foie
Figure 5: Les principales voies impliquées dans les mécanismes moléculaires du cancer en tant que base de données adapté de Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Les protéines surlignés en jaune représentent nos protéines identifiées à partir de notre 2D-LC-MS analyse / MS. Un total de 77 protéines de notre ensemble de données identifiées à partir de notre 2D-LC-MS / MS sont associés aux mécanismes moléculaires du cancer.
Figure 6: La PI3K / AKT / mTOR comme base de données adapté de Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Les protéines surlignés en jaune représentent nos protéines identifiées à partir de notre 2D-LC-MS analyse / MS. Un total de 79 protéines de notre ensemble de données identifiées à partir de notre 2D-LC-MS / MS sont associés à cette voie.
3.5. Vue d'ensemble des points forts du DOC dans l'extraction des protéines à partir d'échantillons de tissus
Notre étude a démontré la faisabilité de l'utilisation de COD dans l'extraction de protéines à partir de tissus de tumeur du foie de poisson zèbre. La figure 7 présente une vue d'ensemble des avantages de l'utilisation DOC comme un tampon d'extraction pour les études protéomiques. DOC est un dénaturant peu coûteux et largement disponible. En outre, son insolubilité de l'acide et la précipitation à un pH bas permettent son retrait de l'échantillon avant l'analyse LC-MS / MS [24]. Ceci est l'une des caractéristiques clés sur les SDS plus couramment utilisés. SDS est impossible à enlever par LC haute performance en phase inverse, et des traces de SDS (# X3c; 0,01 # x25;) va perturber la séparation des peptides avec LC [33. 34]. En outre, SDS supprime l'ionisation dans désorption laser assistée par matrice / ionisation et ionisation par électrospray approche MS [23], ce qui provoque la perte de signal qui pourrait potentiellement conduire à la détection à faible confiance des protéines.
Figure 7: Vue d'ensemble des avantages de DOC comme un tampon d'extraction de protéines pour l'analyse protéomique.
Une autre clé pour obtenir une large couverture des protéines dans une étude de profilage protéome est la digestion complète des protéines en peptides. Ainsi, tout produit chimique ou solvant qui empêche l'activité de l'enzyme (communément trypsine) utilisé se traduirait par digestion enzymatique et une réduction des nombres de peptides. La quantité réduite de peptides se traduira par une détection réduite, et par conséquent l'identification de la protéine sera affectée. Cependant, l'activité de la trypsine est largement affectée par une forte concentration de la solution DOC, même jusqu'à 10 # x25; DOC [16]. Cette propriété permet l'utilisation d'une concentration plus élevée du DOC dénaturant pour aider à solubiliser ces protéines difficiles à solubiliser.
En outre, la valeur de pH de 8 pour DOC facilite également la digestion de la trypsine sans qu'il soit nécessaire de réajuster le pH. En outre, il est également compatible avec l'approche iTRAQ, qui est de loin le plus souvent utilisés de profilage protéomique quantitative approche. Le pH pour l'étiquetage iTRAQ est parfaitement réalisée à un pH de 8. Par conséquent, la valeur du pH ne doit pas être réglé avant l'étiquetage iTRAQ, ce qui réduit la quantité de travail nécessaire, ainsi que des variations de traitement parallèles potentiels de l'échantillon. Fait intéressant, les études protéomiques basées sur iTRAQ ont une étape de réduction du pH avant d'appliquer l'échantillon à SCX. Par conséquent, la réduction du pH pourrait entraîner la précipitation du DOC, d'où son retrait.
L'ajout de la chaleur lors du traitement de notre DOC # x394; échantillon X encore amélioré l'efficacité de l'extraction des protéines du DOC comme l'a souligné dans notre précédente session. La chaleur n'a pas été appliqué à des tampons d'extraction contenant de l'urée, car la chaleur peut décomposer l'urée pour libérer isocyanate qui peut provoquer la carbamylation des protéines [35]. En outre, le chauffage des échantillons de protéines peut induire une agrégation de la protéine sans la présence d'additifs tels que des détergents [36]. Par conséquent, la chaleur pourrait induire l'agrégation des protéines dans les autres tampons de lyse contenant de la faible concentration des détergents et des dénaturants. Cependant, la forte concentration des détergents dans les mémoires tampon de SDS et d'extraction de DOC a empêché l'agrégation des protéines potentiel avec l'ajout de chaleur à notre étape d'extraction de protéine, en soulignant en outre la force de notre procédé DOC-extraction de chaleur.
4. Conclusions
Conflit d'interêts
Jigang Wang et Lee Yew Mun également contribué à cet article.
Remerciements
La recherche de Zhiyuan Gong a été soutenu par le Conseil national de recherches médicales de Singapour. Les travaux de LC / MS ont été menées dans la protéine et Proteomics Center, Université nationale de Singapour.