JBC Journal of Biological Chemistry

protéines Ras sont petites GTPases qui jouent un rôle central dans la prolifération et la différenciation cellulaire. Leur activation dépend de l'action en concurrence des protéines activant GTPase et facteurs d'échange de nucléotides guanine (FEM). Les propriétés des deux mutants dominants négatifs dans les domaines catalytiques de la FEM spécifique à ras, CDC25 mm. sont décrits. In vitro. les protéines mutantes du FEM W1056E et le FEM T1184E sont catalytiquement inactives, sont capables de déplacer efficacement du FEM de type sauvage de p21ras. et de réduire fortement l'affinité des ras sans nucléotidiques · complexe GEF pour le nucleotide entrant, conduisant ainsi à la formation d'un ras stable · complexe binaire FEM. Conformément à leurs propriétés in vitro, les deux mutants GEFs entraîner une réduction spectaculaire de l'activité de fos-dépendants dans des fibroblastes de ras souris. L'expression ectopique stable du mutant GEF W1056E dans les cellules musculaires lisses taux de croissance réduit de manière efficace et la synthèse d'ADN sans aucune modification morphologique détectable.

les protéines Ras sont hautement conservées des protéines de nucléotides de guanine, doté d'une faible activité de GTPase intrinsèque (1). les protéines Ras agissent comme des commutateurs moléculaires que les récepteurs liés à la membrane couple de voies de signalisation intracellulaire qui contrôlent la croissance et la différenciation cellulaire. Dans les cellules, les protéines Ras existent soit dans une forme liée au GTP ( « on ») (état « off ») ou un lié PIB. Le niveau des actifs, les résultats de forme GTP-liée du reste de l'activité concurrente de protéines d'activation de la GTPase et des facteurs d'échange de nucleotide guanine (FEM) 1 (passé en revue dans les références. 1-4). versions oncogènes de p21ras se trouvent principalement sous la forme GTP soit en raison d'une activité réduite GTPasique ou en raison d'un PIB a augmenté / échange de GTP.

Le FEM · cycle a été étudié Ras largement au cours des dernières années. L'analyse mutationnelle des résidus impliqués dans le FEM · interactions a donné un aperçu sur RAS le rôle des résidus impliqués dans l'interaction RAS avec des molécules du FEM (24-27), bien que beaucoup moins d'informations disponibles sur les résidus concernés du FEM (28-30). Seulement l'année dernière, cependant, une analyse cinétique détaillée du FEM · cycle de ras (31) et la structure d'un ras · complexe du FEM (32) été publiés, jeter les bases d'une meilleure compréhension des événements moléculaires complexes responsables pour l'activation de Ras par les facteurs d'échange de nucleotides de guanine.

mutants dominants négatifs dans les petites protéines G sont devenues de plus en plus populaires comme outils dans les études de transduction du signal. Cependant, très peu de facteurs de change négatifs dominants ont été décrits jusqu'à présent. Une classe comprend des molécules FEM antérieures dans leurs domaines catalytiques et leurs propriétés dominantes-négatives sont très probablement due à la liaison non productive aux régulateurs en amont, ce qui entraîne l'interruption de la transmission du signal et la non-activation de ras. Ce type de mutant a été décrit dans les deux Sos (33) et CDC25 Mm (17). Une seconde et potentiellement plus intéressant classe dominante-négative comprend des mutants du domaine catalytique qui sont encore capables de se lier ras, mais qui sont incapables d'induire l'échange de nucléotide guanine. Jusqu'à présent, seule une mutante de cette classe a été décrite dans la levure FEM CDC25, avec la seule preuve de ce mutant agissant comme un mutant dominant négatif étant une réduction d'environ 2 fois la vitesse de croissance dans la levure surexprimant le mutant CDC25 (30) .

PROCÉDURES EXPÉRIMENTALES

Manipulations recombinants génétiques

CDC25 Mm PCR à partir d'ADN génomique et A10 CDC25 Mm RT-PCR

L'ADN génomique a été préparé à partir de plusieurs clones de rat A10 cellules musculaires lisses aortiques embryonnaires transfectées avec le plasmide pcDNA3 recombinant contenant le gène mutant CDC25 MmW1056E selon des protocoles publiés (39). 1 pg d'ADN génomique provenant de chaque clone a été utilisé pour amplifier un fragment interne CDC25 Mm d'environ 800 paires de bases. En bref, l'ADN génomique a été amplifié dans 50 pi de mélange réactionnel de PCR contenant 5 ul de 10 x tampon de PCR (Promega, Madison, WI), 3 pl de 25 mM de MgCl2 (Promega, Madison, WI), 1 ul de 2,5 mm actions de dNTP (Roche Molecular Biochemicals), 50 pmol de chaque amorce (5'-CGTGATCTGGTGGACAATAACCG-3 'et 5'-TCGTCTGCTTAGAAACTTTGAGCC-3'), et 0,5 unités d'ADN polymerase Taq (Promega, Madison WI). Les conditions de cyclage comprenaient une étape de dénaturation initiale à 94 ° C pendant 5 min suivie de 30 cycles de 94 ° C pendant 1 min, 50 ° C pendant 1 min et 72 ° C pendant 2 min. Les mélanges réactionnels de PCR ont été séparées et visualisées dans un gel 1,5% d'agarose coloré au bromure d'éthidium. L'ARN cellulaire total a été isolé à partir de cellules par le procédé de thiocyanate de guanidium acide extraction au phénol-chloroforme comme décrit précédemment (39). 5 ug d'ARN total provenant de chaque échantillon ont été soumis à une transcription inverse en ADNc du premier brin en utilisant un kit de RT-PCR (Stratagene, La Jolla, CA). Des quantités égales d'ADNc ont été amplifiés en utilisant les mêmes amorces oligonucléotidiques et les mêmes conditions de réaction que celles décrites ci-dessus avec la seule différence étant les performances 40 cycles au lieu de 30.

Transfection de souris et Fibroblastes Détermination de l'activité fos-luciférase

des fibroblastes de souris NIH3T3 ont été couramment cultivées dans modifié du milieu Eagle de Dulbecco additionné de 10% de sérum de veau nouveau-né, 100 unités / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine et 2 m m glutamine. Les cellules ont été transfectées de façon routinière avec 1 pg de plasmides pcDNA3-dérivés par le réactif LipofectAMINE (Life Technologies, Inc.) PROCEDE ET cotransfectées avec 0,33 ug du ras responsivefos -luciferase plasmide (21. 40). Dans tous les transfections d'ADN a été tamponnée avec le plasmide pcDNA3 vide jusqu'à un total de 1,5 pg. Après transfection, les cellules ont été privés de nourriture pendant 24 h dans un milieu sans sérum additionné de 4 ug / ml de transferrine et 10 -8 m sélénite de sodium et recueilli. Lorsque cela est nécessaire, les cellules ont été stimulées pendant 16 à 18 h avec soit 100 ng / ml de PDGF ou 20% de sérum de veau nouveau-né. L'activité luciférase a été dosée essentiellement comme décrit (21) en utilisant le système de dosage de luciférase avec un tampon de lyse de rapporteur (Promega) et normalisées par rapport à la teneur en protéines déterminée avec le kit Bio-Rad Bradford.

La transfection de cellules musculaires lisses et détermination de la prolifération cellulaire

A10 rat cellules musculaires lisses aortiques embryonnaires (ATCC) ont été cultivées dans modifié de Dulbecco du milieu de Eagle additionné de 20% de sérum de veau foetal (Hyclone), 2 m m l -glutamine, et 50 ug / ml de sulfate de gentamycine (Sigma). Les cellules musculaires lisses (A10 cellules) ont été transfectées dans 100 mm de diamètre dans des boîtes de Petri de 50% de confluence en utilisant 45 ul / boîte réactif de transfection DOTAP liposomale (Roche Molecular Biochemicals). Chaque plat a été transfecté avec 7,5 pg de plasmides pcDNA3 dérivés. Après la transfection, les cellules ont été laissées se développer pendant 48 h et ont ensuite été divisés et placés dans un milieu de croissance normal supplémenté avec 700 ug / ml de généticine (G418, Sigma). Après sélection pendant deux semaines, des colonies individuelles ont été isolées et cultivées. Tous les clones sélectionnés ont été cultivés en présence de 700 ug / ml de G418. Pour effectuer l'analyse morphologique, les cellules ont été étalées à 5 x 10 3 / cm 2 et cultivées dans un milieu de croissance normal pendant 48 h. Les cellules ont été ensuite lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate, fixées avec du methanol et colorées avec du Giemsa (Sigma). la synthèse d'ADN a été déterminée dans des cellules quiescentes (0,5% de sérum de veau foetal pendant 31 h) de [3 H] thymidine. Différents clones ont été marquées avec 0,5 pCi de thymidine [3H] (Amersham Pharmacia Biotech) en présence ou en l'absence de PDGF (10 ng / ml; Amersham Pharmacia Biotech) pendant 18 h. [3 H] thymidine a été déterminée par comptage de scintillation (Amersham Pharmacia Biotech). Les cellules ont été comptées dans un compteur Coulter. temps de reproduction a été calculé par ajustement de la courbe des données complotant le nombre de cellules comptées en fonction du temps.

La purification des protéines

De type sauvage et des protéines de fusion glutathion-S mutants entre -transferase (TPS) et CDC25 Mm 976-1262. ~58 kDa, ont été purifiés par Chromatographie sur du glutathion-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) comme décrit précédemment (9. 41). Lorsque cela est nécessaire, des protéines de fusion glutathion-Sepharose liées ont été clivés avec de la thrombine (Sigma) et encore purifié par Chromatographie ResourceQ (Amersham Pharmacia Biotech), essentiellement comme décrit (42. 43). Protéine recombinante p21 N-terminale marquée par His a été purifiée à partir ras une souche de E. coli hébergeant un pQE ™ (Qiagen, Valencia, CA) selon la dérivée de plasmide les instructions du fabricant.

Les ras complexes binaires · CDC25 mm a été effectués par incubation d'un facteur 5 excès molaire de ras p21 · PIB à 50 m M de Tris-Cl, pH 7,5, MgCl2 10 m m. 5 tampon m m dithioérythritol contenant 10 m m EDTA avec un mutant ou de type sauvage GST-GEF (pré-lié à la glutathione-Sepharose) pendant 30 min à température ambiante. Le complexe lié a été lavé abondamment avec une solution saline tamponnée au phosphate, 14 m m β-mercaptoéthanol, 1 m m EDTA, 0,5% de Triton X-100. Le complexe a été éluée avec de la glutathione réduite (3 mg / ml dans 50 mM de Tris-Cl, pH 8,5, NaCl 50 mM, β-mercaptoéthanol 14 mm, 1 mM d'EDTA, 0,5% de Triton X-100), dialysées contre 50 mm Tris- Cl, pH 7,5, 50 mM de NaCl, 14 mm β-mercaptoéthanol, 50% de glycerol), et stockés à -20 ° C. Au moins 70% de la protéine GST-GEF a été lié à ras p21 dans ces conditions, à en juger par électrophorèse sur gel.

Guanine Nucleotide Échange et Dissociation Assays

Le taux de dissociation des complexes de nucleotides de guanine Ras-marqué et le PIB à froid à des réactions d'échange de GTP marqué radioactivement sur ras p21 a été mesurée par un essai de liaison de nitrocellulose comme décrit (41). En bref, les complexes marqués ont été préparés par incubation de 1 μ m p21 ras protéine dans du tampon A (50 mM de Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM de MgCl2. 100 mm NH4 Cl, 1 mg / ml de sérum-albumine bovine) pendant 10 min à 30 ° C avec 3 mM d'EDTA et 20 um [3 H] PIB (10,1 mmol Ci -1. Amersham Pharmacia Biotech). MgCl2 (3 m m) a ensuite été ajouté. Le taux de dissociation de ces complexes (concentration finale: 0,2 μ m dans le tampon A) a été mesurée à 30 ° C après l'addition d'un excès de 5000 fois de nucléotide non marqué et la concentration appropriée de type sauvage ou d'un facteur d'échange mutant. Pour le PIB froid [3 H] réaction d'échange de GTP, 0,2 μ m p21 ras protéines ont été incubées à 30 ° C dans du tampon A et la réaction a été démarrée par l'addition de 2 um [3 H] GTP (7,0 Ci mmol - 1 ). ras p21 liØes radioactivité a été déterminée sur 15 pi-échantillons filtrés à travers des disques de nitrocellulose (Millipore, 0,45 um) qui ont été lavées deux fois avec 6 ml de tampon glacé contenant A 10 m m MgCl2. La radioactivité retenue est mesurée dans un compteur à scintillation liquide Packard. Dans la dissociation standard et des dosages de change, des facteurs d'échange ont été utilisés à un rapport molaire 01:10 avec ras p21, i.e.. à 0,02 μ m concentration finale. Pour la détermination des vitesses de dissociation non catalytique, la concentration du FEM a été élevée jusqu'à 30 fois, à savoir dans un rapport de 3: 1 molaire avec ras p21.

Dissociation des sans Nucleotide ras · Complexe du FEM par guanine Nucléotides

dissociation Nucleotide des complexes p21 / de GST-ras CDC25 mm a été analysée de la manière suivante. 100 n m de chacun des complexes purifiés ont été incubés avec diverses concentrations de nucleotides dans 50 m M de Tris-Cl, pH 7,5, 50 m m KCl, MgCl2 5 m m. et 5 m m β-mercaptoéthanol à 4 ° C pendant 15 min et on le laisse se lier à des billes de glutathion-Sepharose. Après un lavage extensif avec une solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,4, les protéines liées aux billes ont été solubilisées dans du tampon d'échantillon, séparés par SDS-PAGE, transférés sur nitrocellulose, et un immunotransfert pour la présence de p21 ras et CDC25 mm à détecter l'association de la p21ras et protéines CDC25 Mm. Les deux anti-anti-ras et CDC25 anticorps étaient de Santa Mm Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Californie). Anticorps secondaires Peroxydase conjugués ont été fromZymed. Les anticorps liés ont été visualisés avec ECL (Amersham Pharmacia Biotech).

La liaison de fluorescence guanine Nucléotides aux sans Nucleotide ras · FEM

nucléotides guanine portant groupe THEN -methylanthraniloy (de Mant) sur ribose (Mant nucléotides) ont été achetés auprès de Molecular Probes (Eugene, OR). Toutes les mesures ont été effectuées à 20 ° C à 50 m M de Tris-Cl, pH 7,5, MgCl2 10 m m. et 5 m m tampon de dithioérythritol en utilisant un Jasco FP-777 fluorimètre à une longueur d'onde d'excitation de 366 nm et une longueur d'onde d'émission de 442 nm.