L'utilisation de l'analyse Dot Blots dans la séparation des anticorps anti-VIH chez les animaux, Accès par DOI

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Article de recherche Open Access

Ange Alberto Justiz 1 * Vaillant. Norma McFarlane-Anderson 2. Patrick Eberechi Akpaka 1. Monica P Smikle 3. Niurka Ramirez 4
et Armando Cadiz 5

2 Département des sciences médicales de base, l'Université des Antilles, campus Mona, Jamaïque

3 Département de microbiologie, l'hôpital universitaire de West Indies, campus Mona, Jamaïque

4 Département de médecine interne, Hôpital Freyre de Andrade, ville de La Havane, Cuba

5 Carlos J. Finlay Vaccine Institute et le sérum, La Havane, Cuba

analyse dot blot; VIH Anti gp120 anticorps; ELISA; Séparation; Les protéines; Immunisation

introduction

Un dot blot est une technique de biologie moléculaire utilisées pour détecter des biomolécules, et pour détecter, analyser et identifier des protéines. Il représente une simplification du transfert de Northern, Southern Blot, ou les méthodes de transfert de Western. La technique offre des économies importantes dans le temps, comme l'électrophorèse sur gel ou Chromatographie, et les procédures de transfert de type complexes pour le gel ne sont pas nécessaires. Cependant, il offre aucune information sur la taille de la biomolécule cible [1].

La production d'anticorps anti-VIH chez les animaux est une alternative sûre dans le développement de réactifs à utiliser dans des essais immunoenzymatiques (ELISA), Western Blot et dot blots utilisés pour diagnostiquer les infections à VIH chez l'homme [2]. Les anticorps peuvent être utilisés non marqué ou marqué aux enzymes et d'autres molécules. Il est une alternative à l'utilisation d'anticorps humains purifiés à partir du sérum des patients séropositifs pour le développement de kits de diagnostic. Dans le présent travail, nous avons produit des anticorps dans trois espèces animales: chats, les rats et les poulets et on séparé les anticorps par analyse dot blot en utilisant des protéines de VIH-conjugués marqués à la peroxydase en tant que sonde. L'anticorps purifié pourrait être utilisé dans le diagnostic ou comme une nouvelle voie de thérapie pour les patients VIH +.

Matériaux et méthodes

Préparation du VIH immunogènes: Cette étude qui a été réalisée au laboratoire de biochimie de l'Université des Indes occidentales, Mona, Jamaïque utilisé un fragment peptidique de la gp120 du VIH-gp120 du VIH (254-274): Cys-Thr-His-Gly -lle-Arg-Pro-Val-Val-Ser-Thr-Gln-Leu- Leu-Leu-Asn-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu [3]; qui a été conjugué à de l'hémocyanine de patelle hemocynin (KLH) par le procédé au glutaraldéhyde comme décrit précédemment dans la littérature [4].

Développement d'anticorps anti-VIH chez les chats et les rats

œufs positifs anti-gp120 ont été nourris aux chats adultes, 2-3 ans (1 hommes et 4 femmes). Chaque chat a reçu en moyenne, de 2 œufs dilué dans 5 volumes de semaine de lait de soja pendant 10 semaines. œuf entier a été alimenté à des rats (2-3 ml) par intubation gastrique; par semaine pendant 9 semaines et au cours de la semaine dernière, ils ont été nourris tous les jours. Le sérum de chats et les rats ont été obtenus après le programme d'alimentation pour la détermination des anticorps anti-VIH en utilisant la méthode qui avait été précédemment décrit dans la littérature [7].

méthode de dosage immuno-enzymatique pour la détection d'anticorps anti-VIH (ELISA)

Le 96 puits des microplaques en polystyrène (en bas en forme de U) ont été revêtues avec 50 ng du peptide synthétique gp-120 dans un tampon de revêtement pendant une nuit à 4 ° C. Les microplaques ont été lavées 4X (PBS-Tween-20) et bloquées (3% de lait non gras dans du PBS, 25 pl / puits, 1 h, température ambiante). Les microplaques ont été lavées 4X (PBS-Tween-20) et triple de 25 ul d'IgY (1 mg / ml), 25 ul de sérums de chats ou des rats dilué 1:16 dans du PBS-lait non en matières grasses ont été ajoutés. Après incubation pendant 2 h à température ambiante les microplaques a été lavée 4X et 25 ul d'un conjugué universel SpLAG-anti-IgY-HRP (composé de peroxydase marqué-IgY chimiquement couplé à la protéine A, la protéine G et la protéine L) [7] dilué 1 : 1000 a été ajouté et mis à incuber pendant encore 1 h à TA. Ensuite, les microplats ont été lavés 4X. Après que 3,3’ , solution (50 pi) 5,5'-tétraméthylbenzidine (Sigma Chemical Co. St Louis, MO, USA) a été utilisé. Après une incubation de 15 minutes dans l'obscurité, la réaction a été arrêtée lorsque les contrôles positifs ont été colorés et inspectés pour le développement de la couleur dans les échantillons positifs et pas de couleur dans les échantillons négatifs. Des contrôles positifs ont été d'un sérum humain positif pour les anticorps anti-VIH, témoins négatifs provenaient d'un sérum de tortue (Sigma Chemical Co. St Louis, MO, USA) et Blanks solution saline normale à 0,9%.

analyse dot-blot des anticorps anti-VIH

En bref, 2 ul de 1: 2 dilutions d'IgY de poulet ou 2 ul de sérum provenant de rats et les chats ont été parsemées sur du papier de nitrocellulose placés dans un appareil de point de Bio- SF (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA). La membrane a été bloquée avec 5 ul / puits de sérum de fœtus bovin à 1% Tris salin tampon. Ensuite, 5 pi d'un conjugué commercial (protéines peroxidaselabeled VIH, Murex Diagnostics, Norcross, États-Unis) a été ajouté et a permis de drainer par gravité. Enfin, 5 ul du substrat 3,3’ , 5,5'-tétraméthylbenzidine (Sigma Chemical Co. St Louis, MO, USA) a été ajouté et le mélange a été incubé pendant 20 min. La réaction a été stoppée par lavage des puits avec de l'eau distillée sous vide. La membrane a été laissée à sécher pour la lecture finale de visualisation des couleurs en utilisant la méthode décrite précédemment [8].

L'étude a été approuvée par le comité d'éthique de la Faculté des sciences médicales, l'Université des Indes occidentales, Mona, Jamaïque.

Les résultats de l'étude est représenté dans le tableau 1 qui montre le test ELISA donnant une réaction positive pour les anticorps anti-VIH dans les échantillons de poulets, des chats et des rats comme toutes les réactions de couleur développées. Et comme illustré sur la figure ci-dessous, les résultats ont révélé que les analyses par transfert de points étaient efficaces et utiles pour détecter les protéines comme ils ont été séparés au cours du processus ou réactions (figure 1).

Figure 1: Résultats d'analyse dot-blot pour la détection des anticorps anti-VIH dans le sérum de plusieurs animaux et testés humaine.

Tableau 1: méthode de dosage immuno-enzymatique pour la détection d'anticorps anti-HIVgp120
anticorps dans les échantillons de poulets, des chats et des rats.

Discussion

Le test ELISA a été avec succès dans la détection des anticorps anti-VIH et l'analyse par transfert de Dot a confirmé les résultats et donc prouvé son efficacité dans la séparation des anticorps anti-VIH contre le fragment 254-274 de gp120 du virus de l'immunodéficience humaine. Le dot-blot peut être utilisée pour la séparation d'une protéine spécifique dans le sérum, la salive, les surnageants de culture d'hybridomes et d'autres fluides. On ne voit pas parmi les techniques de séparation les plus utilisables, mais il est très sensible et spécifique, et peut être utilisé pour de nombreux projets de recherche immunologiques où ce qui est nécessaire la séparation d'un analyte, ainsi que Western Blot, Northern Blot et buvard sud.

analyse dot blot a été utilisé dans la sélection et la caractérisation des aptamères d'ADN (ou ADN pièce pour l'hybridation) pour une utilisation dans la détection de virus de la grippe aviaire H5N19 [9] et en tant que technique de diagnostic a été utilisé dans un test de dépistage pour la détection d'anticorps anti-VIH -1 IgA chez les jeunes enfants [9]. Souvent cette technique est sous-utilisée ou n'est pas souvent utilisé car il ne peut pas évaluer le poids moléculaire des macromolécules. mais il est simple à réaliser et est utile quand il faut identifier une biomolécule particulière. Dans cette étude, l'analyse par transfert de points a été utilisé pour la détection d'anticorps anti-VIH, et il est disponible pour la détermination ou la séparation de toute protéine. Il peut être très utile dans le diagnostic immunologique des maladies infectieuses causées par des virus [10] et les bactéries [1, 11, 12], en plus de la détermination de séquences spécifiques d'ADN en utilisant des sondes [10].

Conclusion

L'analyse par transfert de point se révèle efficace pour séparer le VIH des anticorps anti-gp120 chez plusieurs espèces animales, y compris des poulets, des chats et des rats. Ces anticorps peuvent être utilisés comme réactifs dans le développement de tests de diagnostic immunologique ou des vaccins oraux.

Les références

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