Protocole Dot Blot Checkerboard Titrage des anticorps - Advansta Inc
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Voici les directives et les protocoles généraux pour effectuer des transferts en point, soit en utilisant une unité de microfiltration ou en repérant manuellement la protéine sur une membrane.
dot blots sont semblables à Western blots, mais les protéines ne sont pas séparés électrophorétique avant le transfert à une membrane, mais sont plutôt repérés directement sur une membrane. Parce que les protéines ne sont pas d'abord séparés en utilisant un gel, dot blots ne peuvent pas être utilisés pour déterminer la masse moléculaire d'une protéine et ils ne peuvent établir une discrimination entre des formes alternatives de la protéine (par exemple des protéines clivées). Toutefois, lorsque l'intégrité et l'identité de la protéine est connue, le format dot blot peut être utilisé pour fournir des substrats pour le titrage des anticorps.
unités disponibles dans le commerce pour un transfert de points
dot blots peuvent être effectuées en utilisant des appareils disponibles dans le commerce, des unités de microfiltration souvent appelés. unités de microfiltration offrent une facilité d'utilisation comme buvards de protéines, incubations et lavages peuvent tous être effectués dans l'unité qui isole chaque tache individuelle.
dot blots peuvent également être effectuées sans l'aide d'une unité de microfiltration. Dans ce cas, la protéine est repéré manuellement sur la membrane dans une série de petits points. La région contenant chaque point doit alors être excisé individuellement et traitée séparément pour les incubations et les lavages.
Des échantillons pour dot blot
Des échantillons de protéines pour les anticorps titrantes doivent contenir la protéine d'intérêt en abondance. La protéine recombinante est idéal, cependant lysats de cellules contenant des protéines hautement exprimées peuvent également être utilisés.
Des échantillons de contrôle négatifs peuvent également être inclus, en particulier si les lysats cellulaires sont utilisés. Des échantillons de contrôle négatif détermineront si un signal observé est dû à la réactivité croisée non spécifique.
Préparation des échantillons
Bien que la préparation d'échantillons pour dot blot est similaire à la préparation des échantillons pour analyse Western blot traditionnelle, plusieurs facteurs doivent être gardés à l'esprit. Ceux-ci appliquent à la fois lors de l'utilisation des unités de microfiltration ou lors de repérer la protéine manuellement.
- Préparer suffisamment échantillon dans un volume suffisant pour accueillir toutes les conditions à l'essai
- Ne pas préparer des échantillons dans des tampons contenant des détergents, car ils inhibent la liaison de la protéine à la membrane
- Si les détergents sont présents, diluer les échantillons avec un tampon
- Si un échantillon contient des précipités, centrifugeuse l'échantillon et seulement appliquer le surnageant à la membrane pour éviter le colmatage
- Diluer les échantillons visqueux dans un tampon
Diagramme de transfert de type Dot / conditions
Les directives suivantes doivent être suivies lors de la planification de l'expérience:
procédure de transfert en point en utilisant un appareil commercial
Suivez les instructions du fabricant pour configurer et préparer l'appareil.
- Appliquer l'échantillon dans un volume assez grand pour couvrir la membrane exposée dans chaque puits
- Appliquer l'échantillon dans le centre du bien-être prudent pour éviter de créer des bulles d'air
- Ne pas dépasser la capacité de liaison de la membrane
- Fermer les puits non utilisés en les remplissant avec du tampon d'échantillon
- Suivez les instructions du fabricant pour tirer l'échantillon à travers la membrane en utilisant le vide
- Effectuer des lavages et incubations selon les directives du fabricant
- Retirer la membrane de l'appareil et effectuer une détection ECL en utilisant un kit standard
procédure de transfert en point en utilisant une méthode de repérage manuel
Une procédure de transfert manuel de points suit le même principe que lors de l'utilisation d'un appareil de transfert en point, mais les domaines dans lesquels les protéines sont repérés doivent être délimitées par le dessin d'une grille sur la membrane. En raison de la diffusion de l'échantillon, les volumes plus petits doivent être utilisés lors de repérer manuellement des protéines. Après transfert, les échantillons doivent être physiquement séparés en coupant la membrane avant l'incubation avec les anticorps.