Addgene Protocole - Comment créer une Glycérol bactérienne Stock
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- Création de stocks bactérienne pour Glycérine stockage à long terme de Plasmides
Informations d'arrière-plan
les stocks de glycérol bactériennes sont importantes pour le stockage à long terme des plasmides. Bien que vous pouvez stocker votre ADN plasmidique à -20 ° C, de nombreux laboratoires créent également des stocks de glycérol bactériens de leurs plasmides. De cette façon, lorsque vous voulez faire de l'ADN plus de plasmide, le plasmide sera déjà dans votre souche bactérienne désirée et vous ne aurez pas besoin d'obtenir des cellules plus compétentes et retransformer.
Les bactéries sur une plaque de gélose LB peuvent être conservés à 4 ° C pendant quelques semaines. Cependant, si vous voulez stocker des bactéries pour un temps plus long, vous aurez besoin de constituer des stocks de glycérol. L'ajout de glycérol stabilise les bactéries congelées, la prévention des dommages aux membranes cellulaires et maintenir les cellules vivantes. Un stock de glycérol de bactéries peut être stocké de manière stable à -80 ° C pendant de nombreuses années.
Une fois que vous avez la croissance bactérienne, ajouter 500 ul de la culture pendant la nuit à 500 ul de 50% de glycérol dans un tube supérieur vis 2 ml ou cryovial et mélanger délicatement.
Note: Faire la solution de glycérol à 50% en diluant le glycérol 100% dans dH20.
Remarque: Casser les tubes supérieurs ne sont pas recommandés car ils peuvent ouvrir de façon inattendue à -80 ° C.
Congeler le tube de réserve dans le glycerol à -80 ° C. Le stock est maintenant stable depuis des années, tant qu'il est maintenu à -80 ° C. Ultérieurs cycles de gel et de dégel réduisent la durée de vie.
Pour récupérer les bactéries de votre stock de glycérol, ouvrez le tube et utiliser une boucle stérile, pointe de cure-dent ou d'une pipette pour gratter quelques-unes des bactéries congelées hors de la partie supérieure. Ne laissez pas le stock de glycérol unthaw! Série de bactéries sur une plaque d'agar LB.Faites pousser vos bactéries pendant la nuit à la température appropriée. Les conditions de croissance, y compris le nombre de copies et de la température de croissance, se trouvent sur la page d'information de votre plasmide. Le lendemain, vous serez en mesure de commencer une culture de nuit pour préparation d'ADN plasmidique le jour suivant.
Conseils et FAQ
La concentration optimale de stockage de glycérol à long terme est inconnue. La plupart des laboratoires bactéries magasin à 15-25% de glycérol.
Vous pouvez préparer le stock de glycérol en même temps que vous préparez votre ADN plasmidique. Le matin, lorsque vous reprendrez votre culture bactérienne liquide, prendre 500 ul de la culture pour faire votre stock de glycérol avant de commencer votre plasmide mini-préparation.
Essayez de ne pas geler / dégeler votre stock de glycérol trop de fois. Mise en place du stock de glycérol sur la glace sèche en ensemençant sur agar LB empêchera de décongélation complètement et permettra d'améliorer la durée de vie.
Il est très important que vous secouez le glycérol avant la congélation (5-6 fois). Assurez-vous que vous voyez une solution uniforme, et il n'y a pas de couches présente.
Assurez-vous de l'étiquette à la fois le couvercle et le tube d'un stock de glycérol avant de placer l'échantillon à -80 ° C. tubes congelés sont difficiles à écrire sur des échantillons stockés pendant de longues périodes à -80 ° C peuvent perdre des étiquettes collées au tube!