Block, Stock and Barrel - Un guide pour choisir votre tampon de blocage - Bitesize Bio
Le blocage est la troisième roue essentiel dans toute relation anticorps / antigène. tampon correct de blocage peut perfectionner la capacité de votre anticorps à lier son antigène, alors que mauvais blocage peut rendre un anticorps spécifique de liaison presque impossible. Ne laissez pas mauvais blocage soit une pierre d'achoppement dans vos expériences de Western Blot - lire la suite pour savoir ce que le blocage permette d'obtenir et comment choisir le tampon de blocage correct pour votre transfert de Western.
Pourquoi vous devez bloquer
Avantages - Moins de 7 agents de blocage courants
Votre choix d'un tampon de blocage dépend de trois choses: votre anticorps, votre protéine d'intérêt et votre système de détection. Voici les 7 tampons de blocage communs et quelques conseils importants sur la façon de les utiliser:
1) poudre de lait écrémé
2) albumine de sérum bovin (BSA)
Ceci est une fraction contenant de l'albumine purifiée à partir de sérum bovin et, en même temps que la poudre de lait écrémé, est le bloc le plus commun de choix. Généralement BSA contenant les tampons de blocage sont à une concentration de 2-5%. Cependant, les chercheurs varient souvent la concentration de BSA tout au long de leur protocole à utiliser aussi peu que possible, car il peut être coûteux. Bien que cette BSA est très bien à utiliser avec phosphoprotéines il peut contenir la contamination IgG ou des protéines sériques, ce qui peut donner à votre bruit de fond non spécifique.
3) Gélatine de poisson
L'utilisation de geletin de poisson a évolué de l'utilisation d'un agent de blocage précédent, la gélatine porcine. la gélatine de poisson est purifié à partir de la peau des poissons d'eau froide et présente l'avantage pratique de rester liquide même à des températures froides. Il est utilisé à des concentrations plus faibles allant de 0,1 à 5%. Contrairement à la BSA ou de lait écrémé, de la gélatine de poisson ne contient pas de protéines sériques qui peuvent de réaction croisée avec les anticorps de mammifères, ce qui minimise le bruit de fond. Mais la gélatine de poisson ne peut pas être utilisé pour bloquer avec les systèmes de détection de la biotine, car il contient la biotine endogène.
4) Le sérum normal (par exemple. Sérum de veau foetal, sérum de lapin, sérum de chèvre, etc.)
sérum entier, qui contient un mélange de protéines, peut également être utilisé pour bloquer votre membrane par transfert de Western. Le sérum normal est moins couramment utilisé comme agent de blocage, car il offre peu d'avantages pratiques sur le lait écrémé ou BSA et il est plus cher. Le sérum normal doit également être utilisé à des concentrations plus élevées (
5-10%). Comme BSA, sérum normal contient des immunoglobulines et des protéines sériques qui peuvent de réaction croisée avec les anticorps de mammifères.
5) Purified Caséine
On pourrait dire que celui-ci est une puce de l'ancien bloc, car il est juste une protéine de lait purifiée. Vous pouvez utiliser la caséine où vous utilisez du lait écrémé, mais sachez que la caséine est le présent phospoprotein dans le lait entier, de sorte que ce tampon ne convient pas non si vous essayez de détecter phosphoprotéines.
6) propriétaires buffers commerciaux (par exemple. SuperBlock de Thermo Scientific)
Ceux-ci contiennent généralement des fractions pures d'un mystère de protéine propriétaire. L'avantage de ces tampons est que vous savez qu'il n'y a pas phosphoprotéines, les immunoglobulines, l'albumine ou de la biotine (les méchants dans d'autres tampons de blocage), mais l'inconvénient est que les tampons commerciaux sont plus chers. Les protocoles sont spécifiques à chaque tampon commercial, afin de consulter les recommandations du fabricant. Un grand pro à ces tampons de blocage est que certains d'entre eux sont assez rapide, vous permettant d'être « rapide au large des blocs » pour ainsi dire et se déplacer plus rapidement à vos étapes de détection.
7) Polyvinylpyrrolidone (PVP)
Qu'est-ce tampon à utiliser
Oh, ils peuvent se lier à votre antigène! Voilà pourquoi il faut parfois essayer quelques différents agents de blocage.