PCAMBIA Vecteurs - Cambia - Permettre l'innovation

Une grande partie des informations ci-dessous des vecteurs pCAMBIA anciens

transformation des plantes est désormais une pratique courante dans des centaines de laboratoires dans le monde entier, en utilisant des méthodes de transfert d'ADN ou à médiation bactérienne directe tels que le bombardement. Ces méthodes ont à la fois les limites de la propriété intellectuelle et technique (voir le projet BioForge TransBacter. Dans lequel nous améliorons l'alternative à la transformation pour une plus grande liberté Agrobacterium complète pour fonctionner). L'un des plus grands laboratoires de limites techniques visage est que de nombreux vecteurs sont encore utilisés vestiges historiques avec des caractéristiques inférieures aux normes qui rendent les constructions d'ADN maladroite ou gênante:

Le squelette du vecteur pCAMBIA est dérivée à partir des vecteurs pPZP (construits par Hajdukiewicz, Svab - Maliga, voir les références). Bien qu'imparfaite et ayant des limitations techniques et IP (. Voir le BioForge GUSPlus projet dans lequel nous améliorons les gènes rapporteurs et des méthodes de sélection pour la liberté plus complète de fonctionner), vecteurs pCAMBIA offrent:

Quelques points sur la stratégie de clonage pCAMBIA:

Nomenclature des vecteurs pCAMBIA:

Le système de numérotation à quatre chiffres fonctionne comme suit:

Le premier chiffre - indique la sélection des plantes: 0 pour absence; 1 pour la résistance à l'hygromycine; 2 pour la kanamycine; et 3 pour phosphinothricine (les vecteurs contenant le gène de résistance à la phosphinothricine ne sont plus disponibles à partir CAMBIA à la demande de Bayer, qui détient des brevets limitant son utilisation dans certains pays).

Le deuxième chiffre - indique la sélection bactérienne: 1 pour spectinomycine / résistance à la streptomycine; 2 pour le chloramphénicol; 3 pour la kanamycine; 4 pour spec / strep et de la kanamycine.

Le troisième chiffre - indique polylinker utilisé: 0 pour pUC18 polylinker; 8 pour pUC8 polylinker; 9 pour pUC9 polylinker.

Quatrième chiffre - indique gène rapporteur (s) présent: 0 pour aucun gène rapporteur; 1 pour E. coli gusA; 2 pour mGFP 5; 3 pour gusA: mGFP 5 fusion; 4 pour mgfp5: fusion gusA; 5 pour Staphylococcus sp. gusA (GUSPlus).

Cinquième chiffres - note une autre caractéristique particulière. Jusqu'à présent, cela a été utilisé uniquement avec: pCAMBIA1305.1 et plasmides dérivés, où le 0,1 indique l'absence d'un peptide signal de la protéine GUSPlus ™; et où le pCAMBIA1305.2 0,2 indique la présence du peptide signal de GRP pour la sécrétion de planta de la protéine GUSPlus ™.

lettre calorifugeage - X indique que le gène rapporteur n'a pas son propre codon d'initiation et le vecteur est pour la création d'au journaliste fusion; Z indique la présence d'un lacZa fonctionnel pour le criblage bleu-blanc; a / b / c indique le cadre de lecture pour des fusions avec les vecteurs de fusibles et d'utilisation.

Manuel Vector Addendum: Note importante aux utilisateurs pCAMBIA

Ce vecteur est une partie d'une nouvelle série de vecteurs pCAMBIA GT-back (gène Transfer-bactérienne acquis une compétence avec sélection par la kanamycine) qui comprend une version modifiée de pCAMBIA 1105,1 et un fragment du plasmide Ti (dérivé de pTiBo542) ne contenant que le Vira , virB, virC, vIRD, VIRE, virG, Virk - virJ operons. Ce nouveau vecteur unitaire permet la capacité de transfert d'ADN à déplacer dans et stabilisé dans une gamme beaucoup plus large de bactéries et il sera fourni une boîte à outils open source.
Les caractéristiques à valeur ajoutée du nouveau vecteur sur la technologie Transbacter sont:
- Il peut être distribué sous forme de taches d'ADN dilué sur papier (par exemple sur une lettre) qui élimine la nécessité de se conformer aux contrôles d'importation sur les organismes vivants, et d'autres questions de quarantaine. Ceci est le moyen par lequel des milliers de laboratoires ont obtenus dans le monde entier (et plus envoyés) ensembles de vecteurs pCAMBIA.
- vecteur GT-back n'a pas la RK2 dérivé oriT que Transbacter effectuée, éliminant ou réduisant ainsi la capacité du plasmide à conjuguer et transmissible à d'autres hôtes par des fonctions de conjugaison RK.
- Il a une large origine de réplication de gamme d'hôtes de PVS1 permettant spectre beaucoup plus large de bactéries à explorer en tant que vecteurs de transfert de gènes, ce qui permet des choix de symbiotes bénignes qui n'imposent pas de contraintes physiques ou génétiques sur les plantes.

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pCAMBIA0380; pCAMBIA0390

pCAMBIA1200; pCAMBIA1300; pCAMBIA1380; pCAMBIA1390; pCAMBIA2200; pCAMBIA2300

Les chercheurs qui veulent les dernières versions devraient voir pCAMBIA 1305,1, 1305,2 pCAMBIA1105.1 ou pCAMBIA. qui peut être demandé par le projet BioForge GUSPlus. Des informations sur les vecteurs pCAMBIA plus âgés est ici pour plus de commodité.

Ces vecteurs contiennent des séquences hétérologues minimales pour la transformation des plantes et la sélection des transformants; ils permettent l'insertion de gènes désirés pour transformation dans des plantes, mais exigent toutes les séquences de promoteur et de terminateur de l'expression de la plante des gènes nouvellement clonés.

pCAMBIA1380 et 1390 sont basées sur pCAMBIA1300, mais le fragment polylinker-lacZa pUC18 a été supprimé et remplacé par le plus simple pUC8 (1380) et pUC9 (1390) polylinkers, qui ne contiennent pas potentiellement confondants démarrer ou arrêter codons. Le format complet modulaire est fourni pour le clonage PCR pratique et l'expression des gènes.

Pour les chercheurs qui effectuent des analyses de promoteur l'utilisation du vecteur minimal contenant GUSPlus (pCAMBIA 0305,2. Qui peut être commandé par le projet BioForge GUSPlus) est recommandé, plutôt que l'un des autres vecteurs pCAMBIA. stratégies de co-transformation est souhaitable de séparer physiquement dans le génome de la plante transformée du promoteur du gène de sélection des plantes (habituellement 35S) et le promoteur d'intérêt (souvent beaucoup plus faible ou plus spécifique) entraînant un gus ou un autre gène rapporteur. La façon dont nous faisons cela depuis des années est que deux vecteurs sont transformés séparément dans la même souche de Agrobacterium (ou plusieurs souches de préférence du projet BioForge TransBacter. Pour la liberté d'opérer), mais il est évident co-transformation peut aussi être fait par transformer simultanément avec deux isolats distincts contenant chacun l'un des vecteurs. Si vous utilisez un isolat, des colonies isolées sont sélectionnées, l'ADN plasmidique a analysé, les cellules induites sur des supports spéciaux (si nécessaire pour vos espèces végétales), et les deux lignées cellulaires sont mélangés immédiatement avant l'application sur les tissus végétaux à transformer. Dans nos mains cette méthode donne 10-30% des lignées végétales transformées contenant les deux T-ADN.

pCAMBIA1201; pCAMBIA1301; pCAMBIA2201; pCAMBIA2301

Ces vecteurs contiennent un gus entièrement fonctionnel A construction de rapporteur pour l'analyse simple et sensible de la fonction du gène ou de la présence dans les plantes régénérées par dosage GUS. La construction utilise E. coli gusA (N358Q - pour éviter la glycosylation liée à N) avec un intron (à partir de la graine de ricin du gène de la catalase) à l'intérieur de la séquence de codage pour assurer que l'expression de l'activité glucuronidase est obtenue à partir de cellules eucaryotes, non pas à partir de l'expression par résiduel cellules A. tumefaciens. Le gène rapporteur gusA est cloné dans le nouveau format modulaire. Ces plasmides sont appropriés pour l'insertion d'autres gènes d'intérêt contenant leur propre promoteur et le terminateur. Les chercheurs peuvent exciser le gène gusA et insérer leur propre gène d'intérêt à sa place ou utiliser ces vecteurs pour créer des fusions de gusA avec leur gène d'intérêt (si vous avez créé un dérivé de vecteur pCAMBIA que d'autres chercheurs trouveront utile et aimeraient partager il, s'il vous plaît laissez-nous savoir). Ces vecteurs contiennent le polylinker pUC18-lacZa et les mêmes gènes de sélection bactérienne et végétale que leurs vecteurs de sélection minimales correspondantes.

pCAMBIA1302; pCAMBIA1303; pCAMBIA1304

Pour ceux qui désirent le meilleur des deux mondes gènes rapporteurs, nous avons construit ces vecteurs, similaire à l'utilité de la GUS Intron Sélection Les vecteurs (SIG), mais y compris la GFP. Étant une protéine non catalytique impose une limite intrinsèque de la sensibilité de détection avec des protéines fluorescentes et un équipement coûteux est nécessaire pour des dosages quantitatifs et l'observation microscopique. GFP est néanmoins populaire comme un gène rapporteur et nous lui fournir cloné en plein Nouveau format modulaire pour ceux qui souhaitent l'utiliser.

L'analyse d'un grand nombre de transformants de riz et d'Arabidopsis à CAMBIA a montré que la fluorescence produite par la protéine MGFP5 était assez faible. En raison de cela, nos chercheurs ont construit des constructions similaires en utilisant le gène EGFP disponible à partir de Clontech. Les résultats obtenus avec ces protéines étaient bien supérieures et, même si nous ne parvenons pas à distribuer des vecteurs contenant ce gène, nous recommandons que les chercheurs achètent pEGFP de Clontech et l'utiliser pour construire leurs propres plasmides analogues à pCAMBIA1302, pCAMBIA1303 ou pCAMBIA1304.

pCAMBIA1381 et 1391 et leur Xa, b, c variantes ORF

Conçu pour utiliser gus A comme un véritable rapporteur de l'expression génique par la construction de fusion, ces vecteurs sont dérivés de pCAMBIA1380 et 1390, et contenir un promoteur, gus non-intron A (N358Q) gène (sans codon d'initiation) dans trois cadres de lecture, et soit avec pUC8 ou pUC9 orienté lieurs multisites. Cela permet une construction simple de protéines de fusion terminale carboxy à gusA. sélection des plantes est avec hygromycine et la sélection bactérienne avec kanamycine.

pCAMBIA1281Z; pCAMBIA1291Z; pCAMBIA1381Z; pCAMBIA1391Z

Conçu pour les tests de promoteur dans planta. ces vecteurs comportent une version sans promoteur de gus A (N358Q) avec l'intron de la catalase immédiatement en aval d'un lacZa tronqué contenant soit le polylinker de pUC8 ou pUC9. Tous les plasmides de cette série ont hygromycine que le gène de la sélection des plantes et la sélection bactérienne est disponible avec chloramphénicol (1281Z, 1291Z) ou kanamycine (1381Z, 1391Z). Le lacZa tronqué est fonctionnel pour un criblage bleu / blanc de clones dans des souches de E. coli hôtes appropriées.

Pour éviter ce 35S-interférence des analyses promoteur, nous vous recommandons d'utiliser des stratégies de co-transformation comme décrit ci-dessus dans la section sur les vecteurs de sélection minimale.

Dans une telle stratégie, le promoteur d'intérêt peut être cloné dans l'un de nos promoteur Cloner vecteurs, mais cela devrait d'abord être modifié en effectuant une Smal - Xmnl double digestion, la purification de gel du grand (

8,9 Ko) fragment de squelette, et l'auto-ligature. Un tel vecteur peut être appelé pCAMBIA0381Z, mais on n'a jamais construit pour la distribution dans le cadre du kit de vecteur pCAMBIA.

Génotype de certaines souches utiles tumefaciens Agrobacterium

Les antibiotiques

Chloramphénicol, 100 pg / ml pour la souche AGL1, 10 ug / mL pour LBA4404, 25 ug / mL pour EHA105 et pour E. coli.
Kanamycine, 50 pg / mL pour les deux Agrobacterium et E. coli.
Pour la sélection des plants de riz transformés que nous utilisons hygromycine à 50 pg / ml et 25 pg / mL pour le tabac.

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Autres ressources

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