PNAS, Mobile
Pour déterminer si la stratégie dominante négative peut être utilisée pour bloquer l'inhibition de la croissance TGF-β médiée in vivo. nous avons ciblé surexpression de ΔβRII à l'épiderme des souris transgéniques. Les souris exprimant ΔβRII présentent un épaississement de la peau et ridée, ce qui limite la mobilité homozygotes et conduit à une létalité périnatale. Cette étude documente le rôle du récepteur de type II de TGF-β dans la médiation de l'inhibition de la croissance de l'épiderme in vivo. et souligne en outre l'importance de la voie de signalisation TGF-β dans le maintien de l'homéostasie de l'épiderme.
MATÉRIAUX ET MÉTHODES
Génération et identification des souris ML.ΔβRII Transgenic.
Préparation et analyse de l'ARN.
L'ARN total a été isolé à partir d'épiderme néonatales avec RNAzol B (Tel-Test, Friendswood, TX) comme décrit (13). Pour déterminer les niveaux d'expression du kit transgène ML.ΔβRII, des essais de protection RNase ont été effectuées en utilisant un RPA II (Ambion, Austin, TX) et un 32 ribosonde P marqué spécifique pour ΔβRII. Pour normaliser chaque échantillon d'ARN des différences dans le chargement, une déshydrogénase de glycéraldéhyde-3-phosphate marqué au 32P (GAPDH) ribosonde a été inclus dans chaque analyse. Pour comparer les niveaux d'expression de ML transgène avec celle du gène endogène ML, une ribosonde 32 marqué au P correspondant à 200 pb couvrant à la fois le codage 3 'et les séquences non codantes du gène natif ML a été synthétisé. L'ensemble de sonde 200 pb recuite à des transcrits natifs ML, mais seulement 150 pb de la sonde hybridées à des transcrits du transgène ML. L'intensité des bandes protégées a été déterminée par balayage densitometeric de films à rayons x.
Western Blot analyse.
L'épiderme de la même portée transgéniques ou de contrôle a été séparé du derme (13), et la protéine épidermique total a été extrait comme décrit (14). Une quantité égale de protéine de chaque échantillon a été séparé par électrophorèse sur un gel SDS / PAGE à 12,5% et transféré sur une membrane de nitrocellulose. Une analyse par transfert Western a été effectuée comme décrit (15) en utilisant 10 ug / ml d'un anticorps monoclonal de souris dirigé contre l'épitope c-myc humain (Oncogene Science) et un système de détection Western blot ECL (Amersham).
Histologie des tissus.
BrdUrd Captage et Staining.
Immunofluorescence.
Culture cellulaire et [3 H] thymidine (TdR) Incorporation.
L'expression du ML.ΔβRII Transgène dans les épidermes.
Pour cibler l'expression de la ΔβRII (8) à l'épiderme, on a utilisé un promoteur ML tronqué, qui exprime les deux transgènes dans la base et les couches suprabasales de l'épiderme. La construction et la caractérisation de ce vecteur ont été décrits (19). Fig. 1 A est une vue schématique de ce vecteur contenant le mutant ΔβRII (ML.ΔβRII). Trois lignées transgéniques, B9223, B9273 et C1072, ont été confirmés comme expresseurs transgène par RNase analyse de la protection. Le transgène ML.ΔβRII a été exprimé à un niveau très élevé i.e.. 4 à 5 fois par rapport à celle du gène de la GAPDH dans l'épiderme transgéniques (Fig. 1 B gauche). Pour comparer les niveaux d'expression de ML.ΔβRII avec celle du gène de transcription endogène ML, une sonde qui reconnaît à la fois la endogène (200 pb) et transgène (150 pb) a été utilisé. Notez que les niveaux d'expression du transgène sont d'environ 50% de celle du gène endogène de la loricrine (Fig. 1 B à droite). Une analyse par transfert Western en utilisant un anticorps contre le marqueur c-myc humain, détecté un fondé ΔβRII molécule de 23 kDa dans des extraits de transgénique, mais pas le contrôle, de l'épiderme (fig. 1 C). L'expression du transgène ML.ΔβRII, tel que déterminé au niveau des deux niveaux d'ARN et de protéines, en corrélation avec la sévérité phénotypique de chaque ligne (voir ci-dessous).
Les souris ML.ΔβRII Transgenic présentent une hyperplasiques / hyperkératosique peau Phénotype.
Augmentation de l'indice d'étiquetage.
Pour déterminer le taux de prolifération de l'épiderme ML.ΔβRII par rapport aux témoins, F1 ont été marquées avec littermates BrdUrd à 24 heures après la naissance. Dans l'épiderme normal, les cellules basales ont été marquées avec BrdUrd à raison de 36 ± 8,3 mm / noyaux (Fig. 2 G), alors que dans l'étiquetage ML.ΔβRII épiderme BrdUrd a été porté à 92 ± 2,1 noyaux / mm (Fig. 2 H) . Bien que la majeure partie de l'étiquette se sont produits dans les cellules basales de l'épiderme ML.ΔβRII, certaines cellules suprabasales ont été également marquées (figure 2 H.). Ainsi, ces données confirment à la fois un taux accru de prolifération et une expansion du compartiment prolifératif dans l'épiderme ML.ΔβRII.