RP-HPLC DEVELOPPEMENT ET VALIDATION METHODE POUR QUANTITATIVE GROUPÉ ESTIMATION MÉTRONIDAZOLE
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Int J Pharm Sci Pharm, vol 7, numéro 2, 367-371 Article original
Objectif: développer une méthode exacte, précise et linéaire inverse de la phase liquide à haute performance chromatographique (RP-HPLC) pour l'estimation quantitative simultanée de métronidazole et de l'acide nalidixique en comprimés et valider conformément aux lignes directrices de l'ICH.
Méthodes: Le procédé optimisé utilise une phase inverse colonne C18 colonne C18 Inertsil ODS (250X4.6 mm × 5μ) de phase mobile composée d'un tampon phosphate mixte (pH 4,5; KH2 PO4 + K2 HPO4): methanol: acétonitrile dans la proportion de 30: 50:20 v / v. La phase mobile a été réglée à un débit de 1,2 ml / min et le volume injecté était de 20 ul pour chaque injection. La longueur d'onde de détection a été réglée à 271 nm.
Résultats: La méthode mise au point entraîné métronidazole en éluant à 2,92 min et de l'acide nalidixique à 3,99 min. Metronidazole linéarité exposé dans la gamme 30-70μg / ml, tandis que l'acide nalidixique a présenté une linéarité dans la gamme 45-105μg / ml. La précision est illustrée par les écarts-types relatifs de 0,714% pour le métronidazole et 0,398% pour l'acide nalidixique. Pourcentage de récupération moyens ont été trouvés dans la gamme de 98-102, au cours des études de précision. La limite de détection (LD) pour l'acide nalidixique métronidazole et se sont révélés être 2.48μg / ml et 2.24μg / ml respectivement, tandis que la limite de quantitiation (LOQ) de métronidazole et de l'acide nalidixique ont été trouvés être 7.51μg / ml et 6.79μg / ml, respectivement.
Mots-clés: RP-HPLC, le métronidazole, l'acide nalidixique, l'élaboration de méthodes, de validation.
Metronidazole (fig. 1) est chimiquement 2- (2-méthyl-5-nitro-1H-imidazol-1-yl) éthanol [1]. Le métronidazole est un médicament antibiotique utilisé contre imidazole nitro organismes anaérobies, Amoebozoa infections et protozoaires. Il est fréquemment utilisé pour l'infection à Clostridium difficile légère à modérée [2]. Métronidazole est également utilisé pour traiter la vaginose bactérienne, une maladie inflammatoire pelvienne, la colite pseudomembraneuse. pneumonie d'aspiration. rosacée. blessures bourgeonnante, les infections intra-abdominales, abcès du poumon, gingivites, amibiase, giardiase, trichomonase et les infections causées par des organismes anaérobies sensibles tels que Bacteroides fragilis spp. Fusobacterium spp. Clostridium spp, Peptostreptococcus spp et Prevotellaspp [3]. Il a une formule moléculaire C6 H9 N3 O3 et un poids moléculaire de 171,15 g / mol.
Fig. 1: Structure de métronidazole
l'acide nalidixique (fig. 2) chimiquement est le 1-éthyl-1,4-dihydro-7-méthyl-4-oxo-1,8-naphthyridine-3-carboxylique. Il est un antibiotique quinolone synthétique efficace contre les bactéries gram-positives et gram-négatives. A des concentrations plus faibles, il agit comme un bactériostatique et à des concentrations plus élevées; il est bactéricide [4]. l'acide nalidixique est un inhibiteur de la sous-unité A de l'ADN gyrase bactérienne. l'acide nalidixique est indiqué pour le traitement des infections des voies urinaires provoquées par des micro-organismes sensibles à Gram négatif, y compris la majorité des E. Coli, espèce Enterobacter, l'espèce Klebsiella, Proteus et les espèces. Il agit en tuant les bactéries et en empêchant leur tube de croissance en arrêtant la production de protéines essentielles requises par les bactéries pour survivre. Il a une formule moléculaire de C12 H12 N2 O3 et un poids moléculaire de 232,235 g / mol.
Fig. 2: Structure de l'acide nalidixique
Une étude détaillée de la littérature révèle qu'il existe la littérature sur les méthodes chromatographiques pour l'acide nalidixique et métronidazole individuellement et en combinaison avec d'autres médicaments [4-24] dans différentes matrices. Il existe spectrophotométrique [25], HPTLC [26] et la méthode de chromatographie en phase fluide supercritique [27] pour l'estimation quantitative simultanée d'acide métronidazole et nalidixique dans des formes posologiques pharmaceutiques, alors qu'il n'y a pratiquement pas de littérature rapporté sur le développement du procédé RP-HPLC et la validation de cette combinaison. Par conséquent, nous avons exploré l'élaboration d'une nouvelle exacte, précise, linéaire et un procédé RP-HPLC isocratique rapide pour l'estimation quantitative simultanée de métronidazole et de l'acide nalidixique en comprimés et valider conformément aux lignes directrices de l'ICH.
MATÉRIAUX ET MÉTHODES
Produits chimiques et réactifs
échantillon analytiquement pur de l'acide métronidazole et nalidixique avec des puretés supérieures à 99% ont été obtenus sous forme d'échantillons de cadeau de Chandra Labs, Hyderabad, Inde et formulation de comprimé [Gramogyl Distab] a été obtenue à partir de la pharmacie Medplus, Hyderabad, Inde avec 100 mg de quantité marquée et 150 mg de métronidazole et de l'acide nalidixique, respectivement. Acétonitrile (grade HPLC) et de méthanol (HPLC Grade) ont été obtenus auprès de Sigma Aldrich (Hyderabad, Inde) et SD fin chem. (Hyderabad), respectivement, de l'eau (qualité HPLC), de potassium dihydrogène (qualité AR) phosphate d'ortho (KH2 PO4) et di potassium hydrogène phosphate ortho (K2 HPO4), ont été obtenus à partir de produits chimiques fins SD ortho l'acide phosphorique (grade AR) (Hyderabad, Inde), 0,45 pm filtres à membrane en nylon ont été obtenus à partir Spincotech Private Limited, Hyderabad, Inde.
L'analyse par HPLC a été effectuée sur la pompe Shimadzu LC-20AT VP chromatographe liquide comprenant un LC-20AT, Shimadzu SPD-20A détecteur UV-visible et une colonne phase inverse C18, Inertsil ODS 3V (250X4.6 mm; 5μ). Un injecteur Rheodyne fonctionnant manuellement avec boucle d'échantillon 20 ul a été équipé avec le système de HPLC. Le système HPLC a été contrôlé avec le logiciel « Spinchrom ». Un double faisceau spectrophotomètre UV-visible évolution Nicolet 100 ayant deux cellules de quartz appariés avec 1 cm de trajet optique a été utilisé pour l'enregistrement de spectres et de mesurer l'absorbance. Balance électronique de pesage analytique (sensibilité de 1mg, Shimadzu BL220H), pH-mètre numérique (numérique mondial) et sonicateur (citoyen) ont été utilisés dans cette étude.
La sélection de longueur d'onde
longueur d'onde appropriée pour l'analyse par HPLC a été déterminée en enregistrant les spectres UV dans la gamme de 200-400 nm pour les solutions de médicament individuels de l'acide nalidixique et le métronidazole. longueur d'onde appropriée pour l'estimation simultanée sélectionnée est de 271 nm (fig. 3-4).
La figure 3:. Spectre UV de type Metronidazole
Fig. 4: spectre UV de l'acide nalidixique norme
Le procédé optimisé utilise une phase inverse colonne C18 colonne C18 Inertsil ODS (250X4.6 mm × 5μ) de phase mobile composée d'un tampon phosphate mixte (pH 4,5; KH2 PO4 + K2 HPO4): methanol: acétonitrile dans la proportion de 30:50: 20 v / v. La phase mobile a été réglée à un débit de 1,2 ml / min et le volume injecté était de 20 ul pour chaque injection. La longueur d'onde de détection a été réglée à 271 nm.
Préparation de la solution tampon mixte
1,625 g de dihydrogénophosphate de potassium orth (KH2 PO4) et 0,3 g de phosphate dipotassique d'hydrogène en position ortho (K2 HPO4) a été pesé et dissous dans 100 ml d'eau et le volume a été complété à 1000 ml avec de l'eau. Ajuster le pH à 4,5 avec de l'acide orthophosphorique et d'une solution d'hydroxyde de potassium. Le tampon a été filtré à travers des filtres de 0,45 um pour éliminer toutes les fines particules et les gaz.
préparation de la phase mobile
La phase mobile est préparée en mélangeant de l'acétonitrile, de méthanol et de tampon phosphate mixte dans le rapport 20:50:30 v / v, puis il a été traité par ultrasons pendant 10 minutes pour l'élimination des bulles d'air.
Diluant utilisé est la phase mobile lui-même.
Préparation de la solution étalon mixte
Peser avec précision 75 mg d'acide nalidixique et 50 mg de métronidazole dans 100 ml de fiole jaugée et on dissout dans 10 ml de phase mobile et porter au volume avec la phase mobile. De la solution mère ci-dessus 75μg / ml d'acide nalidixique et 50 pg / ml de métronidazole est préparée en diluant 1 ml à 10 ml avec la phase mobile. Cette solution est traitée comme des étalons de travail mixte, la concentration cible de 100%.
Préparation de stock et de la solution de l'échantillon de travail
10 Les comprimés ont été pesés et placés en un mortier, broyés puis mélangés uniformément. des solutions mères d'essai d'acide nalidixique (1500μg / ml) et de métronidazole (1000 ug / ml) ont été préparées par dissolution moyenne de 10 comprimés, ce qui équivaut à 150 mg d'acide nalidixique et 100 mg de métronidazole et complète à 100 ml avec la phase mobile. Soniqué pendant 5 min et ensuite filtré la solution en utilisant un filtre de seringue de 0.45micron. 0,5 ml de la solution mère ci-dessus a été introduit à la pipette et est rendu jusqu'à 10 ml pour obtenir une solution de l'échantillon de travail équivalente à une concentration de 75μg / ml pour l'acide nalidixique et 50 pg / ml pour le métronidazole, les concentrations correspondant à 100% de concentration cible.
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Un procédé de HPLC en phase inverse a été développée en tenant compte des paramètres d'aptitude du système i. e. facteur de résolution (Rs) entre les crêtes, le facteur asymétrique (A), le nombre de plateaux théoriques (N), l'exécution et la rentabilité. Le procédé optimisé développé conduit à l'élution de l'acide nalidixique à 3,99 min et métronidazole à 2,92 min. Fig. 5 et 6 représentent des chromatogrammes de la solution à blanc et le mélange des solutions étalons, respectivement. La durée totale est de 6 minutes.
tests d'aptitude du système font partie intégrante du développement de méthodes et sont utilisés pour assurer une performance adéquate du système chromatographique. Temps de rétention (Rt), le nombre de plateaux théoriques (N), la résolution maximale (Rs) et le facteur asymétrique (A) a été évaluée pour six injections répétées de la norme à la concentration de travail. Les résultats donnés dans le tableau 1 sont dans des limites acceptables.
Fig. 5: Chromatogramme typique de la solution à blanc
Fig. 6: Chromatogramme typique de mélange de solution standards
Fig. 7: Chromatogramme typique d'une solution d'échantillon
Tableau 1: études pertinence du système des résultats
Afin de tester l'applicabilité de la méthode développée à une formulation commerciale, comprimés « Gramogyl Distab » ont été soumis à une Chromatographie à une concentration de travail et il est représenté sur la figure. 7. Les pics de l'échantillon ont été identifiées en comparant les temps de rétention relatifs avec le mélange de solution de normalisation (fig. 6-7). paramètres d'aptitude du système étaient dans les limites d'acceptation, idéal pour l'échantillon chromatographiée. L'intégration de l'aire du pic séparé a été fait et chaque concentration de médicament a été déterminé en utilisant la relation pic de concentration en surface obtenue dans l'étape de normalisation. Le protocole permet la quantification reproductible des deux médicaments avec une erreur inférieure à 10%, ce qui est le niveau standard à un contrôle de qualité pharmaceutique.
Fig. 5-7 pour le blanc, mélange de solution de médicament de normes et chromatogramme de l'échantillon révèle que les pics obtenus dans la solution de normalisation et de la solution d'échantillon à des concentrations de travail sont seulement en raison des médicaments comme vide n'a pas de pic au temps de rétention de l'acide nalidixique et normes métronidazole. Par conséquent, on peut conclure que, la méthode développée est dite spécifique.
Six injections répétées du mélange de solution de normalisation à une concentration de travail ont montré% RSD (écart type relatif) inférieur à 2 en ce qui concerne les surfaces des pics pour les deux médicaments, qui indiquent la reproductibilité acceptable et de ce fait la précision du système. les résultats de la précision du système sont présentés dans les tableaux 2-3.
précision de la méthode a été déterminée en effectuant une analyse de l'échantillon dans l'essai de reproductibilité (précision intrajournalier) à des concentrations de travail.
Répétabilité (précision intraday)
Six injections consécutives de l'échantillon à partir du même mélange homogène à une concentration de travail a montré% RSD inférieure à 2 concernant% dosage tant pour les médicaments qui indiquent que la méthode mise au point est méthode précise par le test de la répétabilité et peut donc être entendu que le procédé donne des résultats toujours reproductibles (tableau 4).
Tableau 2: Résultats de la précision du système d'acide nalidixique
Fig. 9: graphique de linéarité de métronidazole
La précision a été déterminée au moyen d'expériences de récupération, par la détermination de% de récupération moyenne des deux médicaments à trois niveaux différents (80-120%). A chaque niveau, trois déterminations ont été effectuées. Pour cent récupération moyenne est calculée comme montré dans le tableau 7. Les limites acceptées de la récupération moyenne sont 98% -102% et toutes les données observées étaient dans les limites requises, ce qui indique de bonnes valeurs de récupération et donc la précision de la méthode développée.
Tableau 7: Les résultats des études de précision pour l'acide métronidazole et Nalidixic
% Métronidazole de récupération moyenne
% De récupération moyenne de l'acide nalidixique
La sensibilité de la mesure de métronidazole et de l'acide nalidixique par l'utilisation de la méthode proposée a été estimée en fonction de la limite de quantification (LOQ) et la limite de détection (LD). Et LOQ LOD ont été calculées en utilisant les équations LOD = 3.3σ / S et LOQ = 10σ / S où σ est l'écart type de la réponse d'emplacements d'étalonnage et S est la pente de la courbe d'étalonnage correspondante. La limite de détection (LD) pour l'acide nalidixique métronidazole et se sont révélés être 2.48μg / ml et 2.24μg / ml respectivement, tandis que la limite de quantitiation (LOQ) de métronidazole et de l'acide nalidixique ont été trouvés être 7.51μg / ml et 6.79μg / ml, respectivement.
Les auteurs tiennent à remercier la direction des laboratoires Chandra, Hyderabad, pour fournir les facilités nécessaires pour mener à bien ce travail de recherche, ainsi que pour la fourniture de médicaments sous forme d'échantillons de cadeaux.
CONFLIT D'INTERÊTS